Barthel Bruyns Geburtsjahr überliefert eine 1539 von Friedrich Hagenauer geprägte Münze mit dem Profilbildnis des Malers. Vermutlich gegen 1505 trat Bruyn in die Werkstatt des Jan Joest in Kalkar ein, der damals auch den etwas älteren Joos van der Beke van Cleve beschäftigte. Nach Abschluss der Lehre dürfte er den Kölner Zunftregeln gemäß zunächst in der Werkstatt eines dort ansässigen Malers, vielleicht des Meisters von St. Severin, mitgewirkt haben, bevor er sich in Köln selbständig machen konnte. Vor 1518 wurde er Meister und heiratete seine Frau Agnes (gest. 1550), mit der er fünf Kinder hatte. 1522 und 1529 übernahm er seine bedeutendsten Aufträge für sakrale Werke, nämlich die heute noch erhaltenen Hochaltäre der Stiftskirchen in Essen und Xanten. 1533 erwarb er die zwei Häuser Alden Gryne und Zum Carbunckel in der Nähe von St. Alban, die einst dem Maler Stefan Lochner gehört hatten. Ab 1547 malte Barthel Bruyn mit seinen beiden Söhnen Arnt und Bartholomäus den Kreuzgang des Kölner Karmeliterklosters aus. Zweimal, in den Jahren 1549 und 1553, gehörte er dem Rat der Stadt an. Obwohl er die Werkstatt noch weiterführte, teilte er bereits 1550 seinen Besitz unter den Kindern auf.
Neben der gelegentlichen Behandlung sakraler und allegorischer Themen verdankte er Ruhm und Wohlstand vor allen Dingen den zahlreichen Bildnissen des Kölner Patriziats, dessen gefragtester Porträtist er war. Am besten kommt der repräsentative Charakter seiner Bildnismalerei bei den Standesporträts der Bürgermeister zur Geltung, etwa im 1525 entstandenen Bildnis des Johann von Reidt in der Berliner Gemäldegalerie oder dem 1535 datierten Bildnis des Arnold von Brauweiler des Wallraf-Richartz-Museums in Köln. Dabei überträgt seine Kunst sowohl bei den Porträts als auch bei den religiösen Werken die Errungenschaften der niederländischen Malerei um 1500 in ein niederrheinisch-kölnisches Idiom. Italienische Elemente tauchen nur sporadisch auf und stammen wohl aus zweiter Hand, sind etwa durch Druckgraphik und das Studium der Antwerpner Manieristen vermittelt. Dennoch gibt vor allem das Korpus seiner kühl und distanziert wirkenden Bildnisse einen beachtenswerten bürgerlichen Widerpart zur gleichzeitigen manieristischen Hofkunst ab.
